Nature Communications 13권, 기사 번호: 6115(2022) 이 기사 인용
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혐기성 미생물은 육상 및 수중 생태계에서 대기로의 단쇄 기체 알칸(SCGA, 에탄, 프로판 및 부탄 포함)의 흐름을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 황산염은 SCGA의 미생물 혐기성 산화를 지원하는 전자 수용체 역할을 하는 것으로 확인되었지만, 혐기성 환경에서는 에너지적으로 더 유리한 여러 다른 수용체가 이러한 가스와 공존합니다. 여기에서는 폐수 처리 시설에서 바이오매스를 주입한 생물반응기가 혐기성 프로판 산화와 질산염 환원을 이질소 가스 및 암모늄으로 수행할 수 있음을 보여줍니다. 생물반응기는 1000일 이상 작동되었으며 13C 및 15N 라벨링 실험, 메타게놈, 메타전사체, 메타프로테옴 및 대사산물 분석을 사용하여 미생물 군집 및 대사 과정을 특성화했습니다. 데이터는 Symbiobacteriia 박테리아 클래스 내에서 새로운 순서를 나타내는 종이 관찰된 질산염 의존성 프로판 산화에 책임이 있음을 종합적으로 시사합니다. 우리가 'Candidatus Alkanivorans nitratireducens'로 지정하는 이 유기체의 폐쇄 게놈은 푸마르산염 첨가를 통해 프로판을 CO2로 산화시키는 경로와 질산염 의존성 프로판 산화 중에 발현되는 모든 주요 유전자와 함께 질산염 환원 경로를 암호화합니다. 우리의 결과는 질산염이 혐기성 환경에서 SCGA 산화와 관련된 전자 흡수원이며 탄소와 질소 순환 사이에 새로운 미생물 매개 연결을 구성한다는 것을 시사합니다.
상당한 양의 천연가스가 대륙 가장자리와 육상 생태계의 심해 퇴적물과 탄화수소 누출로부터 생성됩니다1,2. 방출된 천연 가스의 대부분은 가스가 산소 환경과 대기로 확산되기 전에 무산소 구역의 미생물에 의해 소비됩니다3,4,5. 천연가스의 혐기성 산화에 대한 연구는 가장 풍부한 성분(~60~90%)6,7인 강력한 온실가스인 메탄에 초점을 맞춰 왔습니다. 그러나 에탄, 프로판, n-부탄 및 이소부탄을 포함한 단쇄 기체 알칸(SCGA)도 천연 가스의 주요 구성 성분(최대 20%)8이며 오존 및 유기 에어로졸9의 중요한 전구체입니다. SCGA의 전 세계 대기 배출량은 에탄의 경우 9.2~9.6 Tg yr−1, 프로판의 경우 9.6~10.5 Tg yr−1, 부탄의 경우 10 Tg yr−1, 이소부탄의 경우 4.2 Tg yr−1로 추정됩니다10.
메탄의 혐기성 산화(AOM)는 광범위하게 연구되어 비교적 잘 이해되고 있습니다7,11,12,13,14,15,16,17. 혐기성 메탄영양 고세균(ANME)은 주요 메틸-CoM 환원효소(MCR) 복합체를 포함한 역 메탄생성 경로를 통해 메탄을 산화합니다. ANME 셔틀 전자는 메탄에서 신트로픽 황산염 환원 박테리아(SRB)11,12 또는 질산염 및 금속 산화물13,14,15,16의 환원으로 직접 전달됩니다. 박테리아 'Candidatus Methylomirabilis oxyfera'는 아질산염을 유일한 전자 수용체로 사용하는 "호기성 내부" 메탄 산화 경로를 통해 AOM을 수행합니다17. 미생물은 또한 SCGA의 산화를 무산소 조건 하에서 이러한 전자 수용체의 감소와 결합시킬 가능성이 높습니다18. '카. M. oxyfera'는 메탄 모노옥시게나제를 통해 에탄과 프로판을 산화시킬 수 있는 것으로 나타났지만, 이러한 탄소원이 성장을 뒷받침하는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다19. 현재까지 황산염은 SCGA의 혐기성 산화를 지원하는 것으로 확인된 유일한 전자 흡수원이었습니다. Deltaproteobacterial 분리물인 Desulfosarcina aeriophaga BuS5는 알킬숙신산염 합성효소(ASS)20,21에 의해 매개되는 과정인 알킬 치환 숙신산염을 생성하는 푸마르산염 첨가 경로를 통해 프로판과 부탄을 산화시키고 황산염을 황화물로 직접 환원시킵니다. 고세균 'Candidatus Syntrophoarchaeum'의 농축은 다양한 MCR에 의해 촉매되는 과정인 부틸-조효소 M 형성을 통해 부탄을 활성화하는 것으로 밝혀졌으며 환원 당량은 신트로픽 SRB 파트너로 전달됩니다. 유사하게, 혐기성 에탄 산화는 MCR 유사 복합체를 암호화하고 SRB22와 합성 관계를 형성하는 것으로 제안된 관련 'Candidatus Argoarchaeum ethanivorans'와 연결되었습니다. 그러나 황산염 환원과 직접적으로 결합된 혐기성 프로판 산화를 중재할 수 있는 고세균은 아직 확인되지 않았습니다.
90% and >70% bootstrap values, respectively. The scale bars indicate amino acid substitutions per site. b A composite fluorescence micrograph of the enrichment culture hybridized with the SYMB-1018 FISH probe (Cy3, red; targeting ‘Ca. A. nitratireducens’) and stained with DAPI (blue; all microbial cells). ‘Ca. A. nitratireducens’ cells appear magenta (blue + red). The scale bar indicates 20 μm. The representative image was selected based on the visual assessment of six separate hybridisation experiments. Consistent results were also obtained independently with two additional probes targeting the ‘Ca. A. nitratireducens’ population (Supplementary Fig. 8). c, d Relative expression of each genome and unbinned contigs, and microbial metabolism of interest for the genomes in the bioreactor. The total transcripts per million (TPM) was calculated for each gene. Genome sets with overall expression of total TPM > 1% are shown (c). KEGG annotation was used to identify ORFs coding for denitrification (M00529) and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (M00530) pathways (d). Source data are provided as a Source Data file./p> 147.2) of the enriched culture extracts (n = 3, taken at various time points) revealed a peak at retention time 10.832 min, matching the peak of the iso-propylsuccinate standard. b A peak at retention time 11.078 min (ion transition, m/z: 289 > 147.1), corresponding to the peak from the propylsuccinate standard, was observed for cell extracts from the enriched culture (n = 3 at different sampling points). c Phylogenetic relationship of ‘Ca. A. nitratireducens’ AssA (Red) to other AssA and BssA in the NCBI database. Three AssA subunits (AssA123) found in ‘Ca. A. nitratireducens’ MAG formed a separate cluster. Bootstrap values >90% are shown as black dots on branch nodes. Scale bar represents amino acid substitutions per site./p> 147.2) and propylsuccinate (m/z: 289 > 147.1) standards were detected in the cell extracts (Fig. 4a, b). These findings support the hypothesis that ‘Ca. A. nitratireducens’ activates propane through homolytic C-H bond cleavage at both primary and secondary carbon atoms, and with addition of fumarate, yields propylsuccinate and iso-propylsuccinate. In addition, iso-propylsuccinate (5.96 nM) was more abundant than propylsuccinate (2.33 nM) in the culture extracts, suggesting the secondary carbon atom activation generating iso-propylsuccinate is the main route of propane oxidation (Fig. 5)./p> Q5. Among them, 12 million reads were longer than 1000 bp with read N50 of 6,135 bp. Adapters were trimmed using Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop)./p> 30 was selected and mapped to the KEGG Orthology database. The eggNOG v5 database was searched against using emapper 2.1.5 in diamond mode. Conserved motif(s) present within the predicted genes related to propane oxidation and nitrogen metabolism were further verified using NCBI's conserved domain search62. Annotated KO numbers were used for inferring the pathway encoded in each genome. Pathways were identified as ‘not expressed’ if missed blocks > 75% when total blocks > 5, or missed blocks > 1 when total blocks ≤ 5./p>92% similarity), the probes were designed against the 16 S sequence of ‘Ca. A. nitratireducens’ and care should be taken in their application beyond well characterised systems. Given there are no cultured representatives available for probe validation, three FISH probes were designed to target different sites on the ‘Ca. A. nitratireducens’ 16 S rRNA to give higher confidence in their specificity. These included the SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) and SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ) probes. Unlabelled helper probes78 were designed to target the flanking regions of each probe site to increase accessibility to the target site for optimal fluorescent signal (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Helper probes were applied in equimolar amounts with their respective probe. The 5ʹ and 3ʹ ends of the oligonucleotide FISH probes were labelled with the Cy3 fluorophore and were synthesized by Integrated DNA Technologies, Singapore. A higher signal was achieved for these FISH probes with lysozyme pre-treatment of the biomass (0.5 mg ml−1 in 0.05 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH 8) for 30 min at room temperature. The Non-EUB nonsense probe was used as a negative hybridization control79. DAPI (1 ng/µl) staining of cells was performed for 15 min in the dark. The labelled biomass was visualized with a Stellaris5 white light laser confocal microscope (Leica, Germany)./p>
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