암모니아와 멜라닌 생산의 상호 조절은 크립토코쿠스 독성에 영향을 미칩니다

Nature Communications 14권, 기사 번호: 849(2023) 이 기사 인용

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크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 곰팡이는 크립토코쿠스증(cryptococcosis)의 원인 물질입니다. 이 질병은 항진균제로 치료하지 않으면 치명적이지만 현재의 치료법은 숙주 독성과 병원체 저항성으로 인해 방해를 받고 있습니다. 이 치명적인 질병을 퇴치하기 위한 매력적인 대체 접근법은 병원체 유래 병독성 메커니즘을 직접 표적으로 삼는 것입니다. C. neoformans는 이전에 분리된 개체로 연구된 여러 독성 요인을 나타냅니다. 이들 중에는 식세포 pH를 증가시키고 뇌 침입을 촉진하는 우레아제와 면역 세포 및 항진균 치료로부터 보호하는 멜라닌화가 있습니다. 여기서 우리는 이 두 가지 독성 요인 사이의 상호 의존성을 보고합니다. 요소를 가수분해하는 세포는 멀리서 작용하는 암모니아 가스를 방출하여 pH를 높이고 주변 세포의 멜라닌화 속도를 증가시키며, 결과적으로 요소분해효소를 운반하는 세포밖 소포체의 분비를 감소시킵니다. 이러한 상호 관계는 약물 개발을 위한 고립된 독성 메커니즘을 표적으로 삼는 것이 어려운 이유를 설명하고 독성 복합물을 고려하는 보다 전체적인 접근 방식을 주장할 수 있는 창발적 특성으로 나타납니다.

독성 인자는 감염성 미생물에 면역 반응에도 불구하고 감염된 숙주에 손상을 입히고 지속될 수 있는 능력을 부여하는 특성입니다1. 병원체는 표면 코팅, 독소 및 효소를 포함한 여러 독성 요인을 사용하는 경향이 있지만 대부분의 연구는 독성 복합에 ​​대한 기여를 고려하지 않고 단일 요인의 병원성에 대한 독립적인 기여에 중점을 둡니다2. 독성 인자가 상호 작용하는 메커니즘은 미생물 발병기전에서 상대적으로 탐구되지 않은 주제입니다.

C. neoformans는 다당류 캡슐, 멜라닌 생성, 우레아제 및 포스포리파제와 같은 다양한 효소의 발현을 포함하는 다양한 병독성 인자를 발현합니다. 다당류 캡슐과 멜라닌 색소는 각각 식세포작용과 식세포 산화 폭발을 방지합니다3,4. 요소분해효소는 요소를 가수분해하여 암모니아를 생성함으로써 식세포 산성화를 우연히 방해하고 뇌 침입에 중요한 역할을 하는 반면 포스포리파제는 대식세포 식세포 막을 손상시키고 세포내 생존을 촉진하는 영양 효소입니다8. 이러한 독성 요인이 서로 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정보는 거의 없습니다.

이 연구는 크립토코칼 우레아제 활성과 멜라닌화 사이의 상호 작용을 특성화합니다. 우레아제는 세포외 소포에서 방출되고 요소를 가수분해하여 암모니아를 생성하며, 이는 가스로 이동하는 능력을 통해 먼 거리에서 작용을 중재하는 것으로 여기에 표시됩니다. 멜라닌화 반응은 pH에 따라 달라지며 우레아제에 의한 암모니아 생성 증가로 인해 촉진됩니다. 강화된 멜라닌화는 포식체 내에서 크립토코쿠스 세포의 지속성을 선호하여 트로이 목마 메커니즘을 통해 뇌 보급을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다. 세포벽의 멜라닌 침착은 세포밖 소포체 생성을 감소시켜 소포 관련 우레아제의 방출을 억제함으로써 피드백 메커니즘으로 작용합니다. 따라서 우레아제와 멜라닌은 감염의 여러 단계에서 이점을 제공하는 상호 조절을 나타내며 독성 요인의 이러한 조정 및 시너지 효과는 각 구성 요소를 개별적으로 연구할 때 예상할 수 없었던 표현형 변화를 가져옵니다.

빠른 요소배지에서 C. neoformans의 요소분해효소 활성을 분석하는 동안 배양 시간이 길어지면 무세포 웰의 배지도 pH가 증가한다는 사실을 발견했습니다(그림 1a, 왼쪽 패널). 각 웰에 대해 560nm(A560)에서 흡광도를 측정하면 무세포 웰의 색상 변화와 인접한 웰의 세포 수 사이의 직접적인 선형 관계가 나타납니다(그림 1a, 오른쪽 패널). 이 현상이 우레아제 활성에 의존하는지 확인하기 위해 야생형(WT) 또는 우레아제 결핍(ure1Δ) 세포를 24웰 플레이트의 한 웰에 있는 우레아 브로쓰에서 성장시키고 나머지에는 무세포 배지와 함께 성장시켰습니다. 23개의 우물. 30°C에서 24시간 동안 배양한 후, WT 세포와 여러 주변 웰을 포함하는 웰의 배지는 노란색에서 분홍색으로 색상이 바뀌었지만 ure1Δ 세포가 포함된 플레이트에서는 색상 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 1b, 왼쪽 패널). 무 세포 배지의 A560과 암모니아를 생성하는 WT 세포까지의 거리 (그림 1b, 오른쪽 패널) 사이의 S 자형 관계는 중간 점이 pKa 인 pH 적정 곡선과 유사합니다. 데이터의 볼츠만 곡선 맞춤은 56mm의 중간점 값을 제공하며 이 거리 내의 8개 웰에 있는 배지의 pH가 요소 배지 내 페놀 레드의 pKa인 7.9 이상으로 증가했음을 나타냅니다. 0~200ppm 범위의 휴대용 암모니아 가스 검출기를 사용하면 요소 배지에서 24시간 동안 30˚C에서 성장한 배양물에 대한 30초 판독 동안 최소 시작 세포 밀도 2 x 106개 세포/mL로 암모니아를 검출할 수 있었습니다. 요소 농도가 2%로 일정하게 유지되거나(그림 1c, 왼쪽 패널) 최소 요소 농도가 0.25%이고 세포 밀도가 1 x 108 세포/mL로 일정할 때(그림 1c, 오른쪽 패널). 두 경우 모두, 24시간 동안 생산된 암모니아의 누적량은 훨씬 더 낮은 세포 밀도와 요소 농도에서 배양 배지의 pH가 증가한 것으로 알 수 있듯이 상당히 높았습니다(그림 1c).